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　　咱们就以医学研究为例，看看4o和deep research表现如何：

　　Q：深入研究通过直接修改四个 Yamanaka 因子的蛋白质序列来提高 OSKM 重编程效率的尝试。列出您找到的所有相关论文、作者、使用的方法和结果。研究论文中蛋白质变化的模式和相应的结果，并列出科学家为提高效率而修改的前 3 个域，以及他们认为这些变化有效的原因。

　　4o的回答如下：

　　"人们已探索直接修改山中伸弥因子（Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc，统称为 OSKM）的蛋白质序列，以提高体细胞重编程为诱导性多能干细胞 (iPSC) 的效率。以下是相关研究的摘要，包括作者、方法和主要发现：

　　Klf4 亚型研究

　　作者： Knut Woltjen 等人。 方法：研究不同 Klf4 亚型对重编程效率的影响。 结果：研究发现 Klf4 的长度会影响重编程结果。具体来说，由于起始密码子不同，不同实验室使用的 Klf4 蛋白的长度相差 9 个氨基酸。异构体的选择会影响重编程的效率，这表明 Klf4 中的特定蛋白质序列变异可以调节重编程过程。 2. 含聚精氨酸标签的重组OSKM蛋白的研究

　　作者： “小分子在体细胞重编程中的应用”中引用的研究人员。 方法：利用标记有细胞渗透性聚精氨酸序列的重组 OSKM 蛋白来促进细胞吸收，无需进行基因改造。 结果：标记的重组蛋白成功进入细胞并诱导重编程，无需遗传物质转移。然而，这种方法效率低下，需要大量重组蛋白，限制了其广泛应用。 3 Oct4变体研究

　　作者： “10 月 4 日”中引用的研究人员。 方法：比较 Oct4 与其近亲 Oct1 和 Oct6 诱导多能性的能力。 结果：研究表明，虽然 Sox2、Klf4 和 c-Myc 可以被其各自的家族成员取代，但 Oct4 的近亲 Oct1 和 Oct6 却无法诱导多能性。这凸显了 Oct4 在重编程中在 POU 转录因子中的独特性，表明 Oct4 内的特定序列对于其诱导多能性的功能至关重要。 蛋白质修饰和重编程效率的模式

　　通过这些研究，我们发现，关于山中伸弥因子的修改及其对重编程效率的影响，出现了一些模式：

　　异构体选择：特定蛋白质异构体的选择（例如 Klf4 的长度变体）可显著影响重编程结果。这表明，即使蛋白质序列的微小差异也会改变诱导多能性的效率。 蛋白质标记：在 OSKM 蛋白上添加细胞渗透序列（如聚精氨酸标记），可促进其进入细胞而无需进行基因改造。虽然这种方法可以诱导重编程，但它通常需要高蛋白质浓度，并且效率可能较低。 因子特异性：与 Oct1 和 Oct6 相比，Oct4 的独特功效凸显了特定蛋白质序列在重编程中的重要性。这表明这些因子中的某些域对于其诱导多能性功能至关重要。 为提高重编程效率而修改的三大域

　　根据研究和观察到的模式，山中伸弥因子中的以下领域通常被作为提高重编程效率的目标：

　　DNA结合域：

　　修改原因：改变 DNA 结合域可以增强因子对重编程中至关重要的靶基因的特异性和亲和力。例如，选择 DNA 结合域可能存在变异的 Klf4 特定异构体可以影响重编程效率。 2.转录激活域：

　　修改原因：修改转录激活域可以增加因子的转录活性，从而上调维持多能性所必需的基因。这些域的增强可以通过促进靶基因的表达来实现更有效的重编程。 3. 核定位信号（NLS）：

　　修改原因：增强这些因子内的 NLS 可确保其有效转运至细胞核，从而发挥作用。改善核定位可增加这些因子在其作用位点的可用性，从而提高重编程效率。 研究人员认为这些修改是有效的，因为它们优化了山中伸弥因子的功能能力，确保它们更有效地激活将体细胞重编程为 iPSC 所需的遗传网络。"

　　Deep Research回答：

　　"简介：众所周知，利用 Yamanaka 的 OSKM 因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）进行细胞重编程效率低下（在人类成纤维细胞中通常不到 0.1%）。因此，研究人员对这些蛋白质的序列进行了改造，以提高其重编程活性。下面我们回顾了直接修改 OSKM 蛋白质序列（通过域融合、点突变、截断或因子替换）以增强 iPSC 诱导的关键研究（涵盖小鼠、人类和其他系统）。成功和失败的修改都包括在内，以便提供完整的视角。我们首先列出主要论文，然后讨论它们的方法、结果和新兴主题。

　　重点研究（按时间顺序概述）：

　　Takahashi 和 Yamanaka（Cell，2006 年） ——“通过确定的因素诱导小鼠胚胎和成体成纤维细胞培养物中的多能干细胞。”（Kazutoshi Takahashi、Shinya Yamanaka；2006 年 8 月 25 日）。OSKM 诱导的 iPSC（基线 OSKM，无蛋白质修饰）的里程碑式发现。 Nakagawa 等人（PNAS，2010 年） ——“转化缺陷型 Myc 促进直接重编程。”（Masato Nakagawa 等人；2010 年 8 月 10 日）。证明使用致癌性降低的Myc 变体（L-Myc 或 c-Myc 点突变体）可提高 iPSC 生成效率，同时最大限度地降低致瘤性。 Wang 等人（EMBO 报告，2011 年） ——“通过高性能工程因子对小鼠和人类体细胞进行重编程。”（Yang Wang 等人；2011 年 4 月）。创建了与 VP16 转录激活域融合的合成 OSKM 因子，在小鼠和人类细胞中实现了显著更高的重编程效率。 Hirai 等人（干细胞，2011 年） ——“通过利用 MyoD 转录激活域重塑染色质，大大加速核重编程。”（Hiroyuki Hirai 等人；2011 年）。将MyoD 激活域与 Oct4 融合，显示更快的重编程（MEF 中效率为 5%）和更好的染色质开放。 Hirai 等人（PLOS ONE，2012 年） ——“在无血清培养中使用 MyoD 转录激活域高效生产 iPS 细胞。”（Hiroyuki Hirai 等人；2012 年 3 月 30 日）。优化了 MyoD–Oct4 融合（“ M3O ”）的培养条件，小鼠成纤维细胞中的 iPSC 产量约为 26%，而野生型 Oct4 的产量约为 2%，人类细胞中的 iPSC 产量约为 7%，而 OSKM 的产量仅为 1%。 Hammachi 等人（Cell Reports，2012 年） – “Oct4 的转录激活足以维持和诱导多能性。”（Fella Hammachi 等人；2012 年 7 月）。表明与激活域（例如 VP16）融合的 Oct4 可以维持多能性；Oct4-VP16 嵌合体可以在重编程中取代野生型 Oct4，这表明 Oct4 的激活功能是关键。 Kong 等人（Nucleic Acids Res，2015 年） ——“RK 基序和连接片段之间的功能相互作用决定了 Oct4-DNA 识别。”（Xiangqian Kong 等人；2015 年 5 月）。通过突变 Oct4 的 POU 连接区域中的抑制残基，鉴定出DNA 结合域中功能增强的 Oct4 点突变体，重编程效率提高了约 3 倍。 Shah、Narayan、Ptashne 等人（Cell Reports，2017 年） ——“OCT4 和 SOX2 在重编程人类成纤维细胞中起转录激活剂的作用。”（Shivangi Shah、Santosh Narayan、Mark Ptashne 等人；2017 年 8 月）。证明Sox2-VP16（激活剂融合）可加速和增加人类 iPSC 形成，尤其是在较难重编程的较老供体细胞中。相反，抑制因子融合（Sox2-HP1）可消除 iPSC 形成。 Hou 等人（Nucleic Acids Res，2020 年） ——“同时 最新官网中文的wps的下载地方哪里有结合 DNA 和 RNA 促进 Sox2 的多能性重编程活性。”（Linlin Hou 等人；2020 年 4 月）。在 Sox2 的 C 端结构域中发现了一个对重编程至关重要的RNA 结合基序 (RBM)。删除这个 60 个氨基酸基序 (Sox2-ΔRBM) 是一种不成功的修改，导致 iPSC 菌落数量减少了约 36 倍，这凸显了 RBM 的重要性。 Borisova 等人（iScience，2022 年） ——“结构上发现的 KLF4 变体可加速和稳定重编程至多能性。”（Evgeniia Borisova 等人；2022 年 1 月）。对Klf4 锌指结构域进行了丙氨酸扫描，发现一个突变体（Klf4-L507A）使小鼠和人类细胞中的重编程效率大约翻了一番，并加速了 iPSC 菌落的形成。 Akifuji 等人（Sci. Reports，2021 年） – “MYCL 通过 MYC Box 0 和 2 结构域促进 iPSC 样菌落形成。”（Chiaki Akifuji 等人；2021 年 12 月）。探究了L-Myc 优于 c-Myc的原因。缺失表明 Myc 的Box0 和 Box2 结构域对于有效重编程至关重要（L-Myc 中任何一个的缺失都会消除 iPSC 的形成）。这解释了与 c-Myc 相比 L-Myc 具有更高的功效和更低的致癌性。 （以上是代表性研究；额外的参考文献和细节交织在下面的讨论中。）

　　蛋白质修饰策略及发现：

　　转录激活域与 Yamanaka 因子的融合：一种反复出现的策略是赋予 OSKM 因子超激活域，以更有效地驱动多能性基因。疱疹病毒 VP16 酸性激活域是一种常见的选择 - 它能强有力地招募转录机制。Wang等人 (2011)首次表明，将 VP16 与 Oct4、Sox2 或 Nanog 融合会产生“过度活跃”的因子，从而显著改善重编程。在小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 中，用 Oct4-VP16 替换 Oct4 可使 iPSC 菌落数量增加约78 倍（236 对 3 个菌落）。Sox2-VP16 可使 iPSC 菌落数量增加约 36 倍，而添加 Nanog-VP16 可进一步提高效率（4 因子混合物与 3 个 VP16 融合产生的菌落数量比野生型 OSKM 多 100 倍）。值得注意的是，后来证实Oct4–VP16 单独使用（即使没有 Sox2/Klf4/Myc）能够以 ~0.2–0.3% 的效率重编程 MEF，与完整的 OSKM 混合物相当。同样地，Hammachi 等人 (2012)发现将强激活剂束缚于 Oct4 可维持多能性：Oct4–VP16 融合可以维持 ESC 自我更新并诱导 iPSC，而 Oct4–HP1（异染色质蛋白 1）融合（抑制转录）无法重编程细胞。这些研究确定 Oct4 和 Sox2 在重编程过程中主要充当转录激活剂，扩增它们的激活结构域可大大提高效率。另一种成功的融合策略是连接来自成肌转录因子 MyoD 的结构域。Hirai等人(2011, 2012)创建了一个 Oct4–MyoD 嵌合体（称为“M_3O”），假设它可以更好地重塑染色质。事实上，2011 年，M_3O 与 SKM 重新编程了约 5% 的 MEF。在后续的无血清低密度培养中，Hirai 2012使用 M_3O+SKM实现了25-30% 的效率 - 与相同条件下使用野生型 Oct4 (OSKM) 的约 2% 相比，这是一个巨大的飞跃。M_3O 被证明优于 Oct4 的大型 VP16 融合，这表明 MyoD TAD 特别适合打开胚胎基因位点。值得注意的是，M_3O 也在人类成纤维细胞中起作用（产量约 7%，而 OSKM 为 1%），显示出跨物种功效。这些融合方法一致表明，增强 Oct4/Sox2 的转录激活能力是克服重编程障碍的有效方法。域融合不成功：并非所有因子都能从添加域中受益——结果取决于因子的作用。Wang 等人报告称，将 VP16 与 Klf4 融合或单独表达 VP16 不会增强重编程，这意味着 Klf4 的原生功能或表达水平在他们的系统中没有限制。同样，将阻遏物域(HP1) 完全融合到 Sox2

　　阻断了iPSC 的形成，强调需要通过 Sox2 进行激活（而不是抑制）。这些对照强调，只有特定的修改（Oct4/Sox2/Nanog 的强激活剂）才能产生效率提升，而错误地路由因子的功能可能会消除活性。 域的点突变和内部缺失：一种更精细的方法是突变 OSKM 蛋白内的特定氨基酸或域，以减轻抑制调节或改善 DNA 结合。Oct4 (POU5F1)一直是主要目标。Oct4 包含一个二分 DNA 结合 POU 域（由柔性接头分隔的 POU 和 POUh 子域）和几个调节基序。Kong等人 (2015)发现 Oct4 的 POU 接头突变可以**增强其 DNA 结合和重编程功能。他们表明接头中的谷氨酸残基（例如小鼠 Oct4 中的 E210/E217）与 DNA 结合“RK 基序”（富含精氨酸-赖氨酸的环）形成分子内接触，并部分抑制 Oct4 与 DNA 结合的能力。通过丙氨酸取代破坏这些接触（例如小鼠中的 Oct4-E219A，对应于人类的 E210A）可释放 Oct4 以更积极地结合靶基因。Oct4 三重突变体（接头中的三个谷氨酸变为丙氨酸）的重编程效率比野生型高约3 倍。这些获得功能的 Oct4 突变体仍然需要辅助因子 Sox2/Klf4，但显著增加了菌落产量。这一趋势突出表明，调整 Oct4 的 DNA 界面（通过添加外源wps中文版的最新下载的地址 TAD 或去除自抑制元素）可改善多能性网络的激活。Oct4上的翻译后修饰位点也已成为目标。Brumbaugh等人（PNAS 2012）在人类 OCT4 的 DNA 结合同源域（T234、S235）中发现了两个磷酸化位点，其修饰会损害 Oct4 的功能。他们表明，磷酸化模拟突变体 (T234E/S235E) 受到极大损害 – 它产生的iPSC 菌落比野生型 Oct4 少得多（形成的菌落很少，表明功能丧失）。相反，不可磷酸化的突变体 (T234A/S235A) 的表现至少与野生型一样好（在某些试验中略好一些）。这些结果表明 Oct4 同源结构域的磷酸化通过降低 DNA 结合对重编程效率产生负向调节。因此，突变 Oct4 以阻断该磷酸化可以使Oct4保持在更活跃的 DNA 结合状态，有利于重编程（而强制进行恒定的磷酸化是有害的）。Sox2具有 HMG DNA 结合结构域和 C 末端转录激活区。有趣的是，Hou 等人最近的一项发现。 (2020)发现 Sox2 的 C 端还含有一个RNA 结合基序 (RBM)，有助于重编程。删除这个 60 个残基的 RBM（产生 Sox2-ΔRBM）会严重降低 iPSC 产量——克隆数量减少了 36 倍

　　相对于野生型 Sox2。作者表明 Sox2 的 RBM 使其能够结合某些 RNA，同时仍与 DNA 结合，这有助于在重编程过程中实现体细胞基因沉默和多能性基因激活。这是一次不成功的修改尝试（它阻碍了重编程），但它确定了一个对 Sox2 重编程活动至关重要的新域。它警告说，在不了解其功能的情况下删除或改变域可能会消除因子活性——在这种情况下， Sox2协调 RNA 处理的能力是有效诱导 iPSC 的关键。Klf4是一种锌指 (ZnF) 转录因子，其 C 端有三个 C2H2 ZnF，负责 DNA 结合。Borisova等人 (2022)对 Klf4 的 ZnF 区域进行了系统性诱变，以寻找加速重编程的变体。他们确定了一个单一替换Klf4-L507A，它显着提高了性能。预计位于第 507 位（在第三个锌指中）的亮氨酸会接触 DNA；将其突变为丙氨酸可能会改变蛋白质-DNA 界面。在重编程测定中，Klf4-L507A 始终以更快的速度产生 iPSC 菌落，效率大约是野生型 Klf4 的两倍。例如，在 Nanog-GFP 报告 MEF 中，用 Klf4-L507A 转导的细胞中约 60% 在第 25 天成为 Nanog+ iPSC 菌落，而用野生型 Klf4 转导的细胞中约 30% 成为 Nanog+ iPSC 菌落。该突变体还与人类成纤维细胞一起作用以增加 TRA-1-60+ 多能菌落形成。从机制上讲，L507A 显示出与多能性基因启动子（例如 Klf5）的结合增强，并可能稳定 Klf4 的 DNA 接触构象。有趣的是，Klf4 的大多数其他丙氨酸突变体要么没有影响，要么降低了重编程（几个突变体完全消除了菌落形成）。整个 ZnF 域的缺失同样会消除 Klf4 诱导 iPSC 的能力（例如，缺少两个锌指的突变体无法重编程）。因此，Klf4 的 DNA 结合域可以进行精细调整- 一个特定的变化提高了效率，但许多其他变化破坏了关键的 DNA 接触。L507A 的成功强调了结构引导突变如何产生“过度活跃”的重编程因子。

　　修改 c-Myc 以增强和更安全地进行重编程：原癌基因 c-Myc 可将重编程效率提高约 10-40 倍，但其使用会增加肿瘤发生的风险。研究人员曾尝试改变 Myc 的蛋白质序列以保留重编程功能，同时降低其致癌潜力。Nakagawa等人 (2010)进行了开创性的观察，发现L-Myc（致癌性较低的 Myc 家族成员）可以替代 c-Myc，以比 c-Myc更有效、更特异性地促进 iPSC 生成。在人类成纤维细胞中，L-Myc 产生的 iPSC 产量高于 c-Myc，而在小鼠嵌合体中，L-Myc 不会诱发肿瘤，而 c-Myc 会。他们还测试了转化缺陷的c-Myc 突变体：特别是W136E（Myc 的 Myc Box II 结构域中的点突变）和ΔN2（Myc 的 N 端 Myc Box II 片段的缺失）。这些突变体几乎没有转化活性，但 Nakagawa 等人发现它们仍然增强了 iPSC 的形成- 事实上，它们比野生型 c-Myc 更有效地促进了人类 iPSC 集落。这一惊人的结果表明，Myc 的重编程功能可以与其致癌功能分离。从机制上讲，c-Myc 的 N 端 Myc Box 结构域（MBI 和 MBII）驱动增殖和肿瘤发生，而显然相同或重叠的区域也有助于重置细胞身份；转化缺陷突变体可能仍然激活促进重编程所需的增殖/凋亡基因，但不会触发肿瘤程序。这些发现导致 iPSC 方案中广泛采用 L-Myc 以避免使用 c-Myc。在此基础上，Akifuji 等人 (2021)通过系统地删除保守的Myc Box (MB) 结构域，剖析了为何L-Myc 优于 c-Myc。Myc蛋白有六个 MB 结构域 (MB0–MB5)，可介导蛋白质-蛋白质相互作用。Akifuji 的团队比较了 c-Myc 与 L-Myc 突变体在人类细胞中的重编程能力。他们发现两个结构域——MB0 和 MB2——对于有效的 iPSC 诱导是绝对必要的，尤其是在 L-Myc 中。从 L-Myc 中删除 MB0 或 MB2会完全消除菌落形成（根本没有 iPSC），而删除其他结构域的影响较轻。在 c-Myc 中，MB2 的丢失也是有害的，但 MB0 的丢失更容易被接受（与 L-Myc 不同）。这表明 L-Myc 的卓越性能源于其 MB0 运作方式的功能差异。蛋白质组学分析显示 L-Myc 的MB0 结构域

　　独特地上调细胞粘附和 MET（间充质-上皮转化）相关基因，帮助早期重编程转换。另一方面，MB2 有助于招募 c-Myc 和 L-Myc 中的 RNA 加工因子，影响重编程期间的蛋白质合成和细胞生长。因此，MB0 和 MB2 结构域成为 Myc 驱动重编程效率的关键效应子。这些见解解释了为什么L-Myc（具有完整的 MB0 和 MB2 但致癌性较低）是一个最佳点：它触发有助于重编程的增殖和 MET 过程，而不会强烈激活与 c-Myc 相关的致瘤途径。从蛋白质工程的角度来看，可以想象设计一种模仿 L-Myc 结构域功能的 c-Myc 变体——有效利用 MB0/MB2，同时禁用 MB1/MBII 的促肿瘤元素——作为最佳重编程因子。事实上，2010 年研究中的 MBII 中的 c-Myc-W136E 突变体就是这种部分解耦的一个例子。其他 Myc 修饰：一些研究小组干脆完全省略了 c-Myc（以避免其风险），但这通常会使效率降低约 10-100 倍。其他人尝试了小分子 Myc 替换或调节 Myc 表达，但这些都不属于蛋白质序列变化。L -Myc 交换和MBII 突变体仍然是对 Myc 因子本身的主要蛋白质水平调整，从而改善了重编程结果。

　　趋势和有效策略：这些研究呈现出清晰的模式。一个主要主题是增加核心多能性因子（Oct4、Sox2、Nanog）的转录激活能力可产生更多 iPSC。无论是通过融合强效激活域（VP16、MyoD TAD）还是通过去除抑制性磷酸化位点和自抑制接触，目标都是更强烈、更迅速地驱动内源性多能性基因（Oct4、Nanog 等）。这通常意味着多能性基因网络的激活程度更高、更早，从而在更短的时间内产生更多菌落。例如，VP16 融合因子比野生型因子更快地重新激活沉默多能性位点。因此，增强转录激活是一种反复成功的策略。除此之外，优化 OSKM 的 DNA 结合相互作用是另一种富有成效的方法——以更高亲和力或特异性结合靶位点的 Oct4 和 Klf4 突变体可产生更多 iPSC 菌落。本质上，使这些因素更好地找到并启动正确的基因可以改善重编程。

　　另一个趋势是调节因子结构域以将“好的”重编程功能与“坏的”副作用区分开。c-Myc 就是一个例子：通过修改来降低 Myc 的致癌转化活性（例如去除 MBII）同时保持其促增殖活性，从而增强重编程和安全性。同样，Kong 等人发现的一个 Oct4 突变体 (Oct4-E208A) 显示出更高的重编程效率，而不会破坏其他必要的蛋白质-蛋白质相互作用，本质上是一种更清洁的激活功能wps的免费版下载地址。相反，一些修改告诉我们什么不能改变：例如，删除 Sox2 的 RBM 会削弱重编程，表明该结构域的积极作用；同样，某些 Klf4 ZnF 突变体会​​消除活性，表明这些残基是不可或缺的。在分析中包括此类“不成功”的尝试有助于确定哪些结构域是绝对必要的，哪些结构域可以通过工程改造获得功能。

　　最常针对的区域：从集体数据来看，在增强 OSKM 功能的努力中，三个蛋白质区域是最常被修改的区域：

　　转录激活域 (TAD) –虽然 OSKM 因子有自己的激活域，但研究人员经常添加异源 TAD来放大其效果。病毒VP16 TAD是典型的例子，在 Oct4、Sox2、Nanog 融合的多项研究中使用。MyoD TAD（来自肌肉 TF 的强酸性激活剂）是另一种，用于 Hirai 的 Oct4-M_3O。这些域会大量招募辅激活剂（p300/CBP、Mediator 等），因此经过修饰的因子可以强有力地开启体细胞染色质通常会沉默的多能性基因。TAD 融合之所以有效，是因为它绕过了表观遗传激活中的一些限速步骤 – 例如，Oct4-VP16 可以在比野生型 Oct4 更低的蛋白质水平下激活内源性 OCT4 和 NANOG 基因座。总之，VP16 和其他外源 TAD是 OSKM 的流行且有效的补充，通常可使效率提高几个数量级（例如，菌落增加 10-100 倍）。该策略在多个实验室中跨物种（小鼠和人类）取得成功，使得 TAD 融合成为迄今为止发现的最具影响力的修饰类型。 DNA 结合域和接头（Oct4 POU 域和 Klf4 锌指）： OSKM 与 DNA 接触的部分及其相邻的调节基序是另一个常见焦点。Oct4 的 POU 域经过两种设计：(i)小沟结合 RK 基序或其接头的表面突变，增加了 DNA 结合亲和力并产生了更有效的重编程；(ii)防止抑制性修饰（如同源域中的 Oct4 T234/S235 磷酸化）以保持 DNA 结合的稳定性。这些修饰针对 Oct4 作为转录因子的“核心业务”：通过确保 Oct4 更积极地结合正确的基因（通过结构变化或通过去除会削弱结合的磷酸盐），可以更轻松地重置细胞的命运。 Klf4 的锌指结构域类似 - KLF4-L507A突变体改变了第三个 ZnF 的界面，显然允许更紧密或更长时间地与多能基因启动子结合。该突变体使 iPSC 产量翻倍，甚至使产生的 iPSC 在 Nanog 表达中更加同质，表明重编程的质量有所提高。一般来说，突变 DNA 接触残基（在 Oct4 和 Klf4 的情况下为阳性）或 POU 因子之间的域交换（例如 Oct4 与效率较低的 Oct6，如一些研究中所检查的）是常见的实验。反复出现的结果是，DNA 结合域的相对较小的变化可能会对重编程效率产生巨大影响 - 可能是因为结合位点亲和力/特异性是 OSKM 激活内源性多能性基因的有效性的关键决定因素。 Myc 的 N 端 Myc Box 结构域（尤其是 MB0 和 MBII）：对于 c-Myc（及其变体 L-Myc），转录激活结构域中的Myc Box 区域是重编程与转化的关键调节因子。许多研究（Nakagawa 2010、Akifuji 2021）认为MBII（Myc Box II）是促进重编程所必需的，也是 Myc 致癌作用的原因。MBII 中的点突变 W136E 破坏了与组蛋白乙酰转移酶复合物（TRRAP/p400）的相互作用——这会消除转化但仍允许重编程辅助。同时，MB0（Myc Box 0，位于极端 N 端的一个鲜为人知的结构域）成为 L-Myc 中的另一个主要贡献者。MB0 在 c-Myc 和 L-Myc 之间略有不同，Akifuji 等人发现它会影响重编程过程中的细胞粘附基因表达和 MET。由于MB0 和 MBII (MB2)是修改 Myc 行为的“热点”，因此它们是 Myc 工程研究中最常改变的域。研究人员要么交换整个因子（c-Myc → L-Myc，有效改变 MB0/MBII 环境），要么在这些域中创建特定的突变体/缺失。这些修改的有效性不仅通过菌落计数来衡量，还通过iPSC 的质量和安全性来衡量。例如，使用 L-Myc（具有完整的 MB0 但固有的致癌性减弱）产生的 iPSC 系有助于产生没有肿瘤的小鼠生殖系。因此，针对 Myc 的 MB 域一直是提高重编程风险收益比的有效策略——保持高效率同时降低癌症风险。 跨物种和其他背景：上述大多数修改都在小鼠和人类细胞中进行了测试，结果大致相似。VP16 融合在两个物种中都有效（尽管绝对效率不同）。MyoD–Oct4 在小鼠中显示，部分在人类中显示。Myc 的 L-Myc 优势在小鼠（嵌合体）和人类成纤维细胞中得到证实。Klf4-L507A 在小鼠 MEF 和人类细胞（成纤维细胞和角质形成细胞）中进行了功能验证。这种跨物种一致性表明这些蛋白质水平的调整利用了重编程过程的基本机制。还值得注意的是，较早的研究通过展示野生型 OSKM 能做什么和不能做什么奠定了基础（例如，需要 Oct4 和 Sox2 作为激活剂，没有 c-Myc 时效率会严重下降）。在此基础上，较新的进展使用现代工具（结构建模、丙氨酸扫描、磷酸化蛋白质组学等）合理设计改进的因子版本。

　　结论：总之，大量研究试图通过改变蛋白质序列来“增强”山中因子。成功的方法包括将强激活结构域（例如 VP16、MyoD TAD）附加到 Oct4/Sox2、在 Oct4 或 Klf4 中引入点突变以增强 DNA 结合或防止抑制性磷酸化，以及使用 Myc 变体或突变体将重编程效力与致瘤风险分离。这些修改已在重编程效率方面产生量化收益- 通常将 iPSC 产量从远低于 0.5% 提高到百分之几或更高，在特殊情况下（MyoD-Oct4）提高到两位数。同样重要的是，研究有效和无效修改已经阐明了哪些蛋白质结构域对于重编程至关重要。排名前三个的目标结构域是：(1) 外源性转录激活结构域，如 VP16（用于扩增转录激活）； (2)先锋因子的核心 DNA 结合域（Oct4 的 POU 和 Klf4 的 ZnF，包括它们的调节连接基序）；以及 (3) c-Myc/L-Myc 的Myc Box 域（控制增殖和转化之间的平衡）。据信，这些区域的修改通过解锁因子的潜在活性（例如减轻自抑制或招募更多辅助因子）或通过断开重编程过程中不需要的功能（例如致癌作用）起作用。

　　从早期的里程碑式发现到最近的进展，这一发展轨迹表明该领域已日趋成熟：从最初交换整个因子（c-Myc 到 L-Myc）到域级工程和精确的氨基酸替换。每次迭代改进都让我们更多地了解了重编程的生物学。虽然还没有单一的“超级因子”使重编程成为常规，但汇总的证据清楚地表明，蛋白质工程可以提高效率上限。结合多种增强功能（例如，使用 Oct4-VP16 + Sox2-VP16 + Klf4-L507A + L-Myc 混合物）可能会协同产生更高的效率，一些研究已经开始探索这个想法（Wang 2011 使用三种合成因子是朝这个方向迈出的一步）。最后，直接修饰 OSKM 蛋白已被证明是改进 iPSC 技术的有效策略，既能提供实际好处（更快、更高产量的重编程），又能更深入地了解细胞命运转换背后的结构-功能关系。

　　资料来源：

　　Takahashi 等，2006.Cell 126(4):663-76。PMID 16904174。 Nakakawa 等人，2010。PNAS 107(32)：14152-7wps电脑版的下载方法。 Wang 等，2011.EMBO Rep 12(4):373-8。 Hirai 等，2011.干细胞29（8）：1349-61。 Hirai 等人，2012.PLoS ONE 7(3):e34149。 Hammachi 等人，2012 年。细胞报告 1(2)：99-109。 Kong 等，2015.核酸研究43（9）：4381-92。 Shah (Narayan) 等人，2017.Cell Rep 21(8):2100-2116。 Hou 等，2020.核酸研究48(7):3869-3884。 鲍里索娃等人，2022。iScience 25(1)：103525。 Akifuji 等人，2021。Sci Rep 11：24254。 "

　　感觉这个深度研究还是有点东西，大家有空的话可以问问官网最新版的wps下载的地方是什么如何回答，看看两者是不是在一个级别上面，目前呢就只能在ChatGPTPro的会员才能使用，后续会陆续更新到plus和team类型的订阅会员上。